基因点突变是指将外源突变位点通过同源末端重组（HDR）的方式与基因组中特定位点进行替换，从而达到基因的定点突变并获得稳定遗传的一种技术。目前点突变的实现方式主要为CRISPR/Cas系统联合Donor序列同时转入细胞，通过胞内的同源重组修复机制在Cas切割位点处引入Donor序列上含有点突变位点的基因序列。


点突变细胞株查询入口

一、点突变细胞（PM）定制服务

相比于传统的HDR（Homologous Directed Recombination），BE和PE基因碱基编辑系统，无需DSB即可实现编辑，因此更加高效、安全。 

基因碱基编辑BE（Base editing）技术提供了不引入DNA双链断裂和外源工体DNA模板的条件下，就可以对单碱基进行转换的可能性。BE基因编辑系统能实现4种单碱基编辑（C→T, G→A, A→G, T→C）;但仍有8种编辑不能实现（C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G）。

先导编辑PE (Prime Editing) 基因定点突变技术最高效、最安全的，相比于CBE和ABE单碱基编辑器；PE最大的优势在于多样的编辑类型，包括多位点编辑、DNA短片段插入和缺失（<100bp）。艾森基因凝聚十多年基因编辑经验，在上千例基因编辑细胞项目经验中总结、优化、提升，成功率远超传统基因定点突变系统。

细胞类型 常规细胞系、肿瘤细胞系、IPS/ES等各类细胞
方案类型 RNP法、质粒抗性法、BE单碱基编辑器、PE单碱基编辑器
服务类型 单位点/多位点突变
交付成果 纯合子克隆/杂合子克隆
周期/价格 在线咨询；添加官方微信号：18520176000（手机同号）

二、点突变方案

CRISPR/Cas9（HDR）

PE（Prime Editing）

CBE：嘧啶碱基转换技术（C/G到T/A）
 
ABE：嘧啶碱基转换技术（A/T到G/C）
 

PE（Prime Editing）

Step1：pegRNA是设计一段带有转录模板（携带想要的基因信息）和必要Prime Binding Site（PBS）的 PE 编辑专用 gRNA。
Step2：Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA序列指引下，切割DNA单链，pegRNA 3′-端的PBS（引物结合序列）可以与切割断点前的互补序列识别配对。
 
Step3：逆转录酶（M-MLV RT）以pegRNA上PBS序列后的人工设计的模板序列为模板进行逆转录，将目标序列直接聚合到切口的DNA链上。
 
Step4：编辑后的DNA 双链延伸出一段额外新合成的 DNA Flap，启动细胞自有的3‘flap-5’flap equilibration 机制，将 DNA 原有的片段切除。
 
Step5：不匹配的DNA 双链通过错配修复（mismatch repair，MMR）机制，把非编辑链修复，整个编辑过程就完成了。

三、服务流程及质量控制

基因/细胞分析→sgRNA设计/oligo合成或Donor构建→细胞电转及PM效果鉴定→单克隆化→测序分析→复检及扩增。

 

 

四、AI-CRISPR™技术优势

1. AI-CRISPR™技术优势：拥有多种方案实现细胞点突变；满足不同客户需求；具有更高的基因切割效率与同源重组效率，基因编辑效率提升10-20倍。

2. 成熟的技术平台：大量成功案例，在超300种细胞中成功实现超数千例基因编辑；可提供从细胞基因表达调控、细胞功能验证及表型分析的全流程服务。

3. 应用广泛：AI-CRISPR™基因编辑轻松实现基因 敲除/点突变/敲入；承诺项目失败全额退款，成功保障安全无忧。

4. 严格的质量控制体系：进行细菌、支原体等微生物的双重检测，确保100%无污染，并充分鉴定基因编辑效果；进行细胞活率检测，保证交付质量。

五、突变位置分类

1. 编码区域

a. 沉默突变：尽管序列发生了变化，这种突变通常会导致整合进多肽链中的氨基酸没有发生变化，这种点突变对蛋白质的结构没有影响，也因此被称为沉默突变。

b. 错义突变：导致不同的氨基酸会被整合进多肽链中。错义突变的影响取决于突变后新的氨基酸与野生型氨基酸在化学上的差异。

c. 无义突变：是指将编码氨基酸的密码子（有义密码子）转换为终止密码子（无义密码子）。无义突变会导致合成出来的蛋白质会比野生型的要短，并且编码出来的蛋白通常不起作用。

2. 非编码区：在基因的非编码区内的突变实际上是可以影响基因的表达和功能的。

a. 内含子可能包含某些序列，这些序列会结合其他可转录的增强子或沉默子（但这些元件的不是基因所必需的包含），因此在这些区域中形成的突变是有可能影响基因的转录。

b. 内含子还包含非编码RNA的序列（如miRNA，lincRNA），这些序列可能会影响所在基因（和/或其他基因）的mRNA的翻译和稳定性。当突变改变这些RNA的加工或序列的时候，一定会改变基因产物的产生量。

c. 在剪接过程中，内含子会有更高级别的调节。当内含子中的剪接信号发生了突变（剪接因子结合的地方），这有可能会改变内含子这一调节功能。在这些区域中的突变可能导致产生差异剪接或截短的产物，而这些产物可能是不起作用的，甚至有了不同的功能。

d. 在翻译水平上，UTR参与调节蛋白质生产的活性，因此在UTR（非编码区）的突变可能会影响蛋白质的生产量。

六、案例分析

种属 人
细胞名称 HCT116细胞
基因/位点 基因：CTNNB1；突变位点：c.98C>T
培养体系 DMEM-H＋10% FBS＋1% P/S
基因型检测 针对gRNA打靶位置及其附近基因组序列进行测序。测序结果与理论序列一致
细胞转导 1530v , 20ms ,1次；电转体系：10 uL
克隆形成率 细胞增殖能力较好
PCR筛选 筛选克隆数量：175； 杂合子数量：18；纯合子数量：3
PCR方案1
电泳图示例1  
实验结果 单克隆测序结果显示，突变成功
克隆状态