基因敲除细胞系(KO)

文献解读：CRISPR基因编辑BEAS-2B细胞系——希望就在呼吸之间

1. BEAS-2B细胞背景

BEAS-2B细胞是从肺癌个体的正常人支气管上皮病理切片分离出的上皮细胞。这个细胞引种自ATCC CRL-9609，又可被称为 支气管上皮细胞。BEAS-2B细胞系最初是通过使用腺病毒12-SV40杂交病毒感染，并通过连续细胞传代建立的永生化细胞系，它保留了对血清反应进行鳞关分化的能力，这种能力可用于筛选诱导或影响分化及致癌的化学或生物制剂，因此 BEAS-2B细胞被认为是研究药物代谢活化作用和呼吸系统肿瘤以及分子机制理想的细胞模型。

2. BEAS-2B的应用

BEAS-2B 细胞在成骨和成脂分化方面与 hMSCs 具有相似的潜力

将细胞分化诱导21天后，用油红染色分化脂肪细胞中的脂质液泡，然后使用茜素红染色分化骨细胞中的钙沉积。结果表明BEAS-2B和在成骨发生或脂肪发生方面均显示出几乎相同的阳性染色，这说明BEAS-2B 细胞能像hMSC1细胞一样能在诱导后表现出很强的骨细胞和脂肪细胞分化能力。

目前，BEAS-2B已被广泛用于研究肺癌发生的细胞和分子机制，其中包括上皮间质转化（EMT）在肺癌和肺炎球菌感染中的作用等。此外，BEAS-2B细胞系已被用作体外细胞模型，用于检测和筛选具有潜在肺毒性或肺部致癌性的各种化学和生物制剂。

3. 使用AI-CRISPR™在BEAS-2B细胞中实现基因编辑

基因编辑和细胞模型的建立对于推进功能基因组学、信号通路、新陈代谢、细胞死亡、药物发现、药物反应和癌症研究等领域具有重要的意义。BEAS-2B细胞作为研究药物代谢活化作用和呼吸系统肿瘤以及分子机制的理想细胞模型，已经有许多研究人员利用CRISPR/Cas9技术对其进行编辑以研究癌症特征、耐药机制的披露、癌症治疗、细胞死亡研究、功能基因组学、信号通路、药物发现、药物反应和细胞治疗等多种具有重要意义的课题。艾森生物研发的AI-CRISPR™（基于CRISPR/Cas9技术）在DNA双链的切割上比一般的CRISPR/Cas9系统更有效率，不仅可以显著提高同源重组的效率，还能同时在体内外实现高效的基因编辑，对于BEAS-2B细胞的基因编辑实验有着极大的优势。

图1 使用AI-CRISPR™在BEAS-2B细胞中基因编辑过程

3.1 AI-CRISPR™基因敲除BEAS-2B细胞系

通过病毒转导、脂质体转染或核转移将gRNA和Cas9转移到细胞中，然后通过药物筛查后，产生单克隆，最终阳性克隆将通过测序进行验证。具体案例如下：

图2  BEAS-2B细胞系的敲除策略

P53基因是氡照射致BEAS-2B细胞恶性转化中的重要影响因素。在人正常肺上皮细胞（BEAS-2B）中 敲除P53基因，并对基因敲除后的BEAS-2B细胞和正常BEAS-2B细胞分别进行氡染毒处理。研究人员发现，BEAS-2B细胞敲除P53基因后氡照射的BEAS-2B细胞更早地出现了恶性转化。相较于BEAS-2B细胞染氡组(2B-Rn)，P53基因敲除的BEAS-2B细胞染氡组(P53 KO-Rn)增殖速度更快（P<0.05），形成克隆的时间更早（P<0.05）， 侵袭力更强（P<0.05），上皮-间质转化（EMT）相关基因mRNA表达水平变化也更早（P<0.05）。结果表明，氡照射导致BEAS-2B细胞发生恶性转化，并且P53在氡气致肺癌中具有重要作用。

参考：http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201910-45.

3.2  基因敲入或基因点突变BEAS-2B细胞系

BEAS-2B细胞通过电穿孔法与gRNA、Cas9和Donor载体共转染，然后挑单克隆。阳性克隆将通过测序进行验证。具体案例如下：

图3 BEAS-2B细胞系的敲入策略

（1）敲入案例

为了研究突变体NRASQ61K在血管再生中的特异性影响，在正常（非肿瘤）人支气管上皮细胞(BEAS-2B)中进行了敲入。与野生型(WT)细胞相比，在CAM上生长的NRASQ61K 过表达细胞的特征是血管系统紊乱，并存在若干个出血区域。为了证实体内NRASQ61K的促血管生成作用，在裸鼠身上进行了Matrigel plug试验，结果如图5B中所示，NRASQ61K表达细胞显示出血管再生明显增加，呈亮红色。然而， 野生型细胞中的血管再生可以忽略不计，并且血红蛋白水平较低。除此之外，研究者还发现NRASQ61K在体外的表达显著增加了类毛细管网络，如图5C所示。而肿瘤血管生成的关键所在正是细胞在骨髓上自发形成毛细血管样结构，因此，NRASQ61K的表达会在一定程度上促进肿瘤血管的生成。

图5 将NRASQ61K敲入BEAS-2B细胞

（2）点突变案例

BEAS-2B细胞通过电穿孔法与gRNA、Cas9和Oligo共转染，然后挑单克隆。阳性克隆将通过测序进行验证。具体案例如下：

图4 BEAS-2B细胞系的点突变策略

COX-2基因启动子区域包含NFκB、AP-1和NFAT结合位点，它们可以被这些转录因子识别，进而导致COX-2的转录。为了确定NFAT是否通过直接结合COX-2启动子区域来调节COX-2的表达，研究人员应用CRISPR/Cas9技术，对COX-2-Luc启动子区域的两个NFAT结合位点进行了点突变。结果表明，这种突变导致亚砷酸盐暴露诱导的COX-2转录受损。并且研究人员发现，与COX-2诱导相比，亚砷酸盐在研究中的NFAT激活达到了更早的峰值。因为亚砷酸盐的暴露只会导致BEAS-2B细胞中的NFAT的激活，而不是AP-1和NFκB的激活，所以亚砷酸盐激活NFAT是BEAS-2B细胞中COX-2诱导的原因。

另外为了证实NFAT3 在 BEAS-2B 细胞中亚砷酸盐诱导的 COX-2 表达中的重要作用，研究人员构建并使用了siNFAT3，他们将细胞用10μm NFAT 选择性抑制剂预处理，然后暴露于20μm亚砷酸盐中，研究人员发现BEAS-2B细胞中siNFAT3的稳定转染导致BEAS-2B细胞中NFAT3蛋白表达的明显降低(图. 6 中b)。siNFAT3对NFAT3表达的特异性抑制阻断了亚砷酸盐诱导的COX-2转录和蛋白质表达(图. 6 中e和h）。

这些结果表明了，NFAT3是BEAS-2B细胞中亚砷酸盐诱导COX-2的主要介质。